Jenis Mikroskop Fluoresensi

Ketika mikroskop ditemukan sekitar tahun 1600 M, para filsuf alam mengalihkan pandangan mereka ke dunia di dalam dunia. Ketika Antony van Leeuwenhoek membuat lensa kecil yang sangat melengkung dan dudukan mekanis untuk menyesuaikan pandangan, ia membuka jendela ke dunia mikroskopis bakteri, sel darah, protozoa, dan struktur seluler tanaman. Namun sepanjang sejarah mikroskop, selalu ada satu pertanyaan: Hal-hal aneh apa yang dilihat melalui lensa? Mikroskop fluoresensi mengacu pada seperangkat teknik yang meminimalkan ketidakpastian itu - karena dalam mikroskop fluoresensi ketika cahaya menyinari sampel, ia menyinari cahayanya sendiri kembali.

Epifluoresensi

Sejauh ini mikroskop fluoresensi yang paling umum adalah konfigurasi epifluoresensi. Dalam mikroskop epifluoresensi, sumber cahaya - biasanya lampu merkuri atau xenon - bersinar melalui filter yang memilih wilayah panjang gelombang yang sempit. Cahaya yang disaring menyinari sampel melalui lensa objektif mikroskop. Cahaya yang masuk diserap oleh fluorofor - label molekuler yang memancarkan cahaya dengan panjang gelombang yang panjang ketika mereka menyerap cahaya dengan panjang gelombang yang lebih pendek. Cahaya dari fluorofor, bersama dengan cahaya yang tersebar dari sumber iluminasi, kembali ke lensa objektif dan ke detektor atau mata. Sepanjang jalan, filter lain menghalangi cahaya iluminasi, sehingga yang tersisa hanyalah cahaya fluoresen dari sampel.

confocal

Sebuah mikroskop epifluoresensi mengumpulkan cahaya dari mana-mana dalam bidang pandang mikroskop. Beberapa cahaya eksitasi diserap sebelum bidang fokus mikroskop, beberapa di bidang fokus dan beberapa di luar bidang fokus. Karena mikroskop mengumpulkan semua cahaya itu, gambar akan berisi gambar cahaya yang tajam pada fokus, tetapi juga akan memiliki cahaya di luar fokus dari daerah lain. Mikroskop confocal memperbaikinya dengan memfokuskan titik laser pada bidang yang sama dengan fokus mikroskop. Kemudian, sebuah lubang jarum diletakkan di depan detektor, di mana ia menghalangi semua cahaya yang tidak berasal dari fokus mikroskop. Dengan memindai sampel, gambar tiga dimensi yang bersih dari objek dapat diperoleh.

multifoton

Dalam mikroskop confocal keselarasan sangat sensitif. Jika titik laser, objektif mikroskop, optik pengumpul, dan lubang jarum mati, bahkan sedikit saja, kinerja mikroskop akan terganggu. Mikroskop multifoton mengatasi masalah ini dengan menggunakan panjang gelombang laser yang energinya hanya setengah dari yang diperlukan untuk merangsang fluorofor dalam sampel. Satu-satunya cara fluorofor akan tereksitasi dan memancarkan fluoresensi adalah jika sinar laser cukup terang sehingga dua partikel cahaya -- foton -- menyerang fluorofor dalam waktu yang sangat singkat. Itu terjadi hanya ketika laser difokuskan ke tempat yang sangat kecil. Jadi satu-satunya tempat dalam sampel yang akan memancarkan cahaya adalah di mana laser difokuskan, yang menjaga gambar tetap bagus dan bersih karena tidak ada cahaya latar tambahan yang harus dihilangkan -- yang berarti tidak ada lubang jarum untuk disejajarkan.

Fluoresensi Refleksi Internal Total (TIRF)

Cara lain untuk mendapatkan gambar yang sangat bersih adalah dengan memastikan cahaya eksitasi tidak masuk terlalu jauh ke dalam sampel. Jika gumpalan neuron, misalnya, ditempatkan dalam setetes larutan pada kaca objek, maka beberapa neuron akan menempel pada permukaan kaca. Dalam mikroskop fluoresensi refleksi internal total (TIRF) cahaya diarahkan menyamping ke slide kaca sehingga tidak benar-benar membuatnya menjadi larutan yang menahan sel. Namun sebagian cahaya nyaris tidak masuk ke dalam larutan -- sangat dekat dengan permukaan kaca. Ini berarti satu-satunya tempat yang akan memancarkan cahaya akan berada di wilayah yang sangat tipis tepat di atas permukaan kaca. Untuk sesuatu seperti neuron, di mana begitu banyak hal menarik terjadi di permukaan sel, teknik ini bisa sangat efektif.

Super-Resolusi

Semua mikroskop - termasuk mikroskop fluoresensi - dibatasi oleh fisika yang mengatur perambatan cahaya. Salah satu aturan dasarnya adalah bahwa titik cahaya yang terfokus hanya bisa menjadi sangat kecil -- dan tidak boleh lebih kecil. Untuk cahaya tampak, ukurannya sekitar 200 nanometer, atau 200 miliar meter. Tetapi molekul tunggal hanya berukuran beberapa nanometer, jadi ada banyak fitur menarik yang berada di bawah batas ukuran itu, yang disebut batas difraksi. Para ilmuwan sedang mengembangkan teknik "resolusi super" untuk menyelinap di sekitar batas itu. Mikroskop iluminasi terstruktur (SIM) dan mikroskop penipisan emisi terstimulasi (STED), misalnya, keduanya adalah metode mikroskop fluoresensi yang membatasi ukuran titik pemancar cahaya dengan mengecilkan ukuran titik cahaya eksitasi.